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考察缩泉丸石油醚部位"缩尿"药理作用

时间:2019/6/26栏目:临床医学论文

考察缩泉丸石油醚部位"缩泉丸"始载于《妇人良方》,由益智仁、山药和乌药组成,功效为补肾缩尿,常用于肾虚所致的小便频数、夜间遗尿等。课题组前期通过缩泉丸君药益智仁对水负荷多尿模型和肾阳虚模型尿量和首次排尿时间的研究发现其主要药效部位为石油醚部位;且以小鼠水负荷多尿模型实验的尿量为指标,通过谱效关系法对缩泉丸缩尿作用的物质基础做了初步研究,灰关联度结果表明,与缩尿作用关联较大的峰集中在极性比较小的部位。在此基础上,本实验通过在体大鼠水负荷多尿模型实验对药效部位进行筛选,同时运用离体肌张力实验对缩泉丸缩尿作用部位进行验证,研究缩泉丸"缩尿"药效物质基础,为缩泉丸的临床应用提供参考。

 

 

1材料

1.1试验

药物益智仁为姜科山姜属植物益智AlpiniaoxyphyllaMiq.的干燥成熟果实(批号:20150312),乌药为樟科植物乌药Linderaaggregata(Sims)Kosterm.的干燥块根(批号:20150314),山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎(批号:20150305),购于荷花池药材市场,经成都中医药大学生药教研室卢先明教授鉴定均符合中国药典2015年版(一部)收载品种。缩泉丸全粉:将盐炙益智仁与其余2味药材粉碎过8号筛,按药典规定1∶1∶1混合为缩泉丸炙品,临用时用0.5%CMC-Na配制成缩泉丸炙品(0.3g/ml)的混悬液。醇水双提液:将粉碎过筛后的缩泉丸全粉用8倍量95%乙醇回流提取2次,每次1h,过滤,滤液合并,减压浓缩,备用;药渣加水煎煮二次,每次1h,滤过,滤液合并,减压浓缩。合并两次浓缩液,配制成含生药0.3g/ml浓度的药液。石油醚部位:按缩泉丸全粉项下处理后,分别粉碎过1号筛,用8倍量95%乙醇回流提取2次,每次1h,过滤,滤液合并,减压浓缩,备用;药渣加水煎煮二次,每次1h,滤液合并,减压浓缩。合并两次浓缩液。浓缩液用石油醚(60~90℃)萃取至上层无色,所得石油醚部位减压回收后于水浴(60℃以下)挥至无醚味。加入2%吐温将样品配制成含生药0.3g/ml浓度的药液乳剂,每100ml药液加盐0.02g。非石油醚部位:用石油醚萃取后剩余的药液稀释为含生药0.3g/ml浓度的药液。盐溶液:称取0.2g盐溶于100ml蒸馏水;吐温溶液:称取吐温-802g,溶于100ml蒸馏水。

1.2动物

清洁级SD雄性大鼠,体重(220±30)g,动物许可证号SCXK(川)2013-24;清洁级豚鼠,雌雄不拘,体重(370±30)g,合格证号SCXK(川)2015-030,由成都达硕生物科技有限公司提供。

1.3试剂

氯化乙酰胆碱(上海源叶生物科技有限公司,批号:201503)。

1.4仪器

RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);BL-420S型生物机能实验系统、JH-2型肌张力传感器、HV-4型离体组织器官恒温灌流系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.5方法

1.5.1水负荷多尿模型造模方法及尿量收集清洁级SD大鼠,购回后适应性饲养1周。实验前18h禁食不禁水,仿Aston法对动物进行筛选,即按体重灌胃生理盐水22ml/kg,使实验动物体内水平衡。收集2h尿液,凡尿量超过40%水负荷者为合格。取筛选合格的大鼠30只,按尿量、体重搭配分成模型组、全粉组、醇水双提组、石油醚部位组和非石油醚部位组5组,每组6只动物。各组按3g/kg体积灌胃给药1周,模型组给予等体积的蒸馏水,末次给药前动物禁食不禁水18h,给药1h后按50ml/kg灌胃生理盐水,挤尽膀胱余尿,置于大鼠代谢笼中记录首次排尿时间与6h内每小时尿量,并计算6h内每小时排泄率和总排泄率。每小时排泄率(%)=每小总尿量/水负荷量×100%总排泄率(%)=6h总尿量/水负荷量×100%1.5.2离体豚鼠膀胱肌条制备和实验准备猛击豚鼠头部致昏,快速取出膀胱,并用低温营养液漂洗干净,存放于通有95%O2+5%CO2混合气体的低温营养液中,备用。从三角区下横切,将膀胱主体部分沿一侧面纵向切开,沿肌纤维走向切取2条纵行肌条(8mm×3mm)。将肌条安置在盛有30ml、37℃的Krebs液平滑肌槽中,持续通以95%O2+5%CO2混合气体。用4号手术线系好肌条,肌条的一端固定在肌槽底部的不锈钢弯钩上,另一端与肌张力传感器连接,传感器连接生物机能实验系统记录肌条收缩时的平均张力和频率。给予肌条负荷1g张力,在37℃的Krebs营养液中温育30min,待肌条自发活动平稳后开始实验,记录2min正常收缩曲线[11~13]。1.5.2.1对正常豚鼠离体膀胱逼尿肌活动的影响将实验动物分为4组(4只/组):正常组、吐温溶液组、石油醚部位组和盐溶液组。石油醚部位组和盐溶液组加药时采用累计加药法,加药间隔为1min,累积浓度分别为50、100、200μl。待豚鼠膀胱肌条自发活动平稳,记录2min正常收缩曲线。正常组不加任何药物,其余组分别给予相对应的药液,记录不同给药剂量1min的收缩曲线,以给药前后膀胱肌条收缩的平均张力、振幅计算变化百分率。张力变化百分率(%)=(给药后张力平均值-给药前张力平均值)÷给药前张力平均值×100%振幅变化百分率(%)=(给药后振幅-给药前振幅)÷给药前振幅×100%振幅变化=最大张力-最小张力1.5.2.2对激动剂作用的豚鼠膀胱逼尿肌活动的影响根据前期实验基础,缩泉丸对M受体有一定的作用,所以实验选择氯化乙酰胆碱(ACH,M受体兴奋剂,浓度1.0×10-5mol/L)作为膀胱肌条平滑肌兴奋剂,再通过考察缩泉丸石油醚提取物对ACH引起的豚鼠膀胱逼尿肌兴奋的抑制作用,以验证缩泉丸石油醚部位的药理作用。ACH+石油醚部位:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后1min,加入石油醚部位混悬液;ACH:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后,不加任何药物,记录5min收缩曲线。ACH+吐温溶液:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后1min,加入吐温溶液;ACH:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后1min,不加任何药物,记录5min收缩曲线。ACH+盐溶液:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后1min,加入盐溶液;ACH+N阴性对照:待离体膀胱逼尿肌自发活动平稳后,加入10μmol/L的ACH后1min,不加任何药物,记录5min收缩曲线。

2结果

2.1对水负荷多尿模型大鼠尿量的影响

结果与模型组相比,全粉组、醇水双提组、石油醚部位组均能显著延长首次排尿时间,石油醚部位组能显著降低6h总排泄率。醇水双提组、石油醚部位及非石油醚部位组能显著降低0~1h时段尿量,醇水双提组能提高1~2h时段尿量,其余时段无显著性差别

2.2对离体豚鼠膀胱逼尿肌的影响

2.2.1对正常豚鼠离体肠肌活动的影响结果与正常组相比,给吐温组、盐溶液组和石油醚部位组张力和振幅变化无显著差异,表明助溶剂吐温、盐溶液和石油醚部位对正常豚鼠膀胱逼尿肌无作用2.2.2对ACH激动的豚鼠离体肠肌活动的影响加入ACH激动剂后,与正常组、吐温与盐溶液张力变化与振幅变化无显著性差异。表明助溶剂吐温与盐溶液对ACH激动的豚鼠膀胱逼尿肌无作用,石油醚部位组能够显著降低ACH激动的豚鼠膀胱逼尿肌的张力和振幅3讨论缩泉丸具有补肾缩尿的功效,临床常用于治疗小儿遗尿、夜尿症、尿失禁、尿频、尿道综合征等。研究表明,缩泉丸可使大鼠尿中Na+、Cl-排出减少,尿K+排出增加,影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴;增加血中血管紧张素、肾素、醛固酮水平,影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统;增加肾阳虚大鼠水通道蛋白2的表达,增加水的重吸收,浓缩尿液等调节机体水液代谢而减少尿量。同时,缩泉丸能通过抑制M受体,抑制储尿期膀胱逼尿肌的收缩力,延长排尿周期。本实验通过对大鼠水负荷多尿模型尿量的影响筛选缩泉丸药效部位,同时利用药物对离体豚鼠膀胱肌条的影响,验证缩泉丸石油醚部位的药理作用。通过水负荷多尿模型大鼠尿量的影响实验结果表明,缩泉丸石油醚部位能减少6h总尿量,说明缩泉丸石油醚部位具有“缩尿”的功能。能延长首次排尿时间,降低0~1h时排尿量,说明缩泉丸石油醚部位能调节膀胱逼尿肌的收缩舒张,延长排尿周期。离体豚鼠膀胱逼尿肌的影响实验结果表明,吐温与盐溶液对正常和ACH激动的豚鼠膀胱逼尿肌均无抑制作用,说明溶剂与辅料盐溶液对膀胱逼尿肌无影响,而缩泉丸石油醚部位能降低ACH激动的豚鼠膀胱逼尿肌的张力和振幅,说明缩泉丸石油醚部位对ACH引起的逼尿肌兴奋有一定的抑制作用,且缩泉丸石油醚部位对膀胱运动抑制作用的靶点在M受体,但其具体的机制还需要进一步的深入研究。

参考文献

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