人结肠癌动物皮下实体瘤模型的建立

人结肠癌动物皮下实体瘤模型的建立

　　人结肠癌动物皮下实体瘤模型的建立
　　
　　黄文革 陈凤英 郭芬芬 刘慰华 李婕 黄河清
　　
　　【摘要】  【目的】 建立临床背景清楚的结肠癌动物皮下实体瘤模型，为结肠癌发病机制及治疗策略的研究提供可靠的实验动物模型？【方法】 采用组织块直接移植法将收集到的12例结肠癌组织临床标本移植到免疫缺陷小鼠右侧肩胛皮下，第1-2代用NOD-Scid小鼠；将每个病例的第2代皮下肿瘤，分别连续皮下接种至NOD-Scid小鼠和BALB/C裸小鼠两组动物中，传代至第5代？观察每个病例在两种品系动物的成瘤时间？标本的成瘤率；进行HE染色和CDX-2及 CK20免疫组化检测？【结果】 本实验NOD-Scid小鼠组的第3代和第5代皮下移植瘤的病例成瘤率分别为92%?58%,BALB/C裸小鼠组的分别为75%?50%?病理切片显示肿瘤组织细胞排列成不规则腺体状，有病理性核分裂相？CDX-2?CK20染色呈阳性？【结论】 初步建立了临床背景清楚的人结肠癌的NOD-Scid小鼠和BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型，为进一步研究结肠癌发病机理及治疗策略奠定基础？
　　
　　【关键词】  结肠癌； NOD-Scid小鼠； 裸鼠； 移植瘤模型
　　
　　Abstract: 【Objective】 To establish subcutaneous solid tumor mice models of human colon cancer which have clear clinical backgrounds. 【Methods】 12 clinical colon cancer specimens were first transplanted to the subcutaneous tissue of right shoulder in NOD-Scid mice by tissue transplantation, Then the passage 2 of the subcutaneous tumor in each cases were implanted contiguously into NOD-Scid mice and BALB/C nude mice, respectively, which were subcultured to passage 5 in mice. The time and rate of tumor formation, HE staining and immunohistochemical examination of CDX-2 and CK20 were observed during the experiment. 【Results】The rates of subcutaneous tumor formation of passage 3 and 5 were 92% and 58% in NOD-Scid mice, while 75% and 50% in nude mice, respectively. The pathological results showed that cells in tumor tissue were gland-like and arranged irregularly, in which pathological nuclear fission was observed. The immunohistochemical stain of CDX-2 and CK20 in cells were positive. 【Conclusions】 The subcutaneous solid tumor models of human colon cancer in NOD-Scid and nude mice were established preliminary, providing a technological foundation for further exploring the pathogenesis and therapy strategy of colon cancer.
　　
　　Key words: colon carcinoma; NOD-Scid mice; nude mice; transplanted tumor model
　　
　　多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome,PCOS），是青春期和育龄妇女常见的生殖内分泌疾病，在育龄期妇女中发病率高达6% —— 10%[1],主要有月经紊乱？持续性排卵障碍？高雄激素血症？高胰岛素血症及卵巢多囊样变等一系列表现；临床表现异质性，约50%的患者合并超重或肥胖？近年来研究发现该疾病的功能紊乱远超出生殖轴，PCOS患者具有肥胖？血脂血糖代谢紊乱等心血管病的高危因素，远期代谢和心血管疾病的危险性增高？研究发现，PCOS女性内皮功能损伤的发生率明显高于正常人群[2],细胞间黏附分子-1（intercelluar adhesion molecule-1,ICAM-1）是反映内皮功能障碍的标志物[3]?本研究通过监测POCS患者血清中sICAM-1的水平，探讨PCOS患者血清sICAM-1与代谢之间的相关性，以预警其发生糖尿病？心血管疾病的风险，以便临床进行早期干预治疗？
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 研究对象
　　
　　选择2009年8月至2010年10月就诊于中山大学附属第三医院不育与性医学科门诊的63例PCOS患者为观察对象，纳入标准符合2003年鹿特丹PCOS诊断标准[4]?选择同时期就诊的29例无PCOS 表现，有正常月经周期和排卵，血清生殖激素正常，由于输卵管等其他原因所致不孕症患者为正常对照组？按体质指数BMI≥25 kg/m2为肥胖[5],将63例PCOS患者分为肥胖组（A组，30例）和非肥胖组（B组，33例），29例正常对照组分为非肥胖组（C组，20例）和肥胖组（D组，9例）；A组患者年龄（27.40 ± 2.53）岁，B组患者年龄（27.09 ± 5.91）岁；C组患者年龄（28.55 ± 4.40）岁；D组患者年龄（26.56 ± 3.64）岁？4组患者在年龄无明显差异，均排除系统性疾病，6个月内未进行过可能影响下丘脑-垂体-性腺轴功能的药物治疗？
　　
　　1.2 方法
　　
　　1.2.1〓一般资料收集〓由专人对受试者测量身高？体质量？血压？腰围？臀围，并进行以下计算：腰臀比（waist/hip ratio,WHR）=腰围（cm）/臀围（cm）？平均动脉压（mean arterial pressure, MAP）=（收缩压+舒张压×2）/3?
　　
　　1.2.2〓基础内分泌标本收集〓患者于月经周期第2 —— 5天或闭经患者阴道B超检查没有优势卵泡时早晨空腹抽外周静脉血用化学发光法测定基础性激素？ 空腹血糖？血脂？胰岛素？口服葡萄糖耐量（OGTT）试验的检测：嘱患者禁食8 h于次日早晨抽肘静脉血，然后口服葡萄糖75 g,于服糖后60?120 min抽血测葡萄糖，采用特异性葡萄糖氧化酶法？放射免疫法分别测定空腹血糖？血脂？胰岛素？并计算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR）：空腹胰岛素（mIU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5?胰岛素抵抗（insulin resistant,IR）诊断依据HOMA-IR≥2.5[6]?
　　
　　1.2.3〓测定sICAM-1〓于抽空腹血糖当日抽取外周静脉血；采用双抗体夹心ELISA测定法测定受试者血清中sICAM-1,各步骤严格按照说明书操作？ELISA试剂盒由杰特伟生物公司提供？
　　
　　1.3〓统计学方法
　　
　　采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（x ± s）描述，两组间各项指标比较首先采用正态性检验和方差齐性检验，若方差齐则用两独立样本t检验，方差不齐则采用t′检验，不符合正态分布的变量采用非参数检验？sICAM-1与各变量关系采用Pearson积矩相关？Spearman积矩秩相关，检验水准取α=0.05,双侧？
　　
　　2 结 果
　　
　　2.1 四组一般资料比较
　　
　　四组一般资料比较见表1?
　　
　　2.2 四组之间IR及向心性肥胖发生情况
　　
　　四组之间IR及向心性肥胖发生情况见表2?
　　
　　2.3 Pearson相关分析
　　
　　①血清sICAM-1与体质量？BMI?WHR?TG?FINS?HOMA-IR?PCOS患病呈正相关（分别为r=0.275,r=0.290,r=0.379,r=0.315,r=0.326,r=0.324,r=0.560;P < 0.05），与HDL-C?收缩压？舒张压？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h无相关性（P > 0.05）（各指标中n=92）？控制BMI这个影响因素之后对sICAM-1与血糖？血脂代谢指标进行偏相关分析，发现血清sICAM-1与WHR?TG?PCOS患病呈正相关（分别r=0.268;r=0.243,r=0.533,P < 0.05）？②PCOS患者血清sICAM-1与体质量？BMI?WHR?TG?HOMA-IR呈正相关（分别r=0.302,r=0.295,r=0.248,r=0.309,r=0.249,P < 0.05）（各指标中n=63），与HDL-C?收缩压？舒张压？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h无相关性（P > 0.05）？
　　
　　3 讨 论
　　
　　PCOS患者约有35% —— 60%表现为肥胖，并且肥胖中80%表现为向心性肥胖[7]?向心性肥胖是心血管疾病一个重要的危险因素？本研究中PCOS患者向心性肥胖发生率为61.90%,其中肥胖型PCOS患者80%为向心性肥胖？国外研究发现50% —— 70%的PCOS患者有IR[1]?IR能够增加机体发生代谢综合征的危险，包括糖尿病？高血压病？血脂异常？血液高凝状态和心脏疾病等？本研究显示PCOS患者IR发生率高达53.97%（其中A组76.67%,B组33.33%）？PCOS患者早期的代谢状况特别是糖代谢的状况研究较少见？本研究显示，空腹血糖（OGTT0h）A组高于B组？OGTT1h?OGTT2h均显示A组高于另三组；B组高于C组和D组？提示PCOS患者存在潜在的糖代谢异常？国外研究显示约70%的PCOS患者血脂代谢异常，PCOS患者以高甘油三酯为特征[8]?本研究发现，PCOS患者总胆固醇？甘油三酯均高于对照组？PCOS患者TC?TG?LDL-C呈逐渐升高趋势，而具有保护作用的HDL-C则呈逐渐降低趋势？高密度脂蛋白的降低？胆固醇及血甘油三酯水平的升高，预示一些PCOS患者晚年发生心脑血管疾病的危险性增高[9]?
　　
　　上述实验研究均证实，PCOS患者具有肥胖？高胰岛素血症？脂代谢紊乱等心血管病的高危因素，远期发生代谢和心血管疾病的风险增高？
　　
　　PCOS患者存在内皮功能失调且抵抗胰岛素血管舒张效应[10]?而动脉内皮功能受损是发生心血管疾病的启动机制和关键因子之一？ICAM-1为跨膜糖蛋白，是白细胞与内皮细胞相互作用的重要黏附分子，由内皮细胞表面脱落在血液中以可溶形式（ sICAM-1） 存在，可反映细胞表面粘附分子表达状态，为内皮功能障碍的早期标志物？动脉粥样硬化的重要起始步骤是单核细胞与血管内皮细胞粘附，ICAM-1是介导这一过程的关键因子，在内皮细胞受到刺激时合成便迅速增加，介导白细胞与血管内皮的粘附[3]?在动脉粥样硬化形成的初期ICAM-1在激活的内皮细胞中表达，纤维斑块形成后，斑块内皮细胞仍强表达ICAM-1?本研究结果显示A组及B组血清sICAM-1均显著高于C组和D组，表明PCOS患者存在动脉内皮细胞的活化与功能异常？相关性分析发现，血清sICAM-1与体质量？BMI?WHR?TG?FINS?HOMA-IR?PCOS患病呈显著正相关，与收缩压？舒张压？TC?LDL-C?脂蛋白？OGTT0h?OGTT1h?OGTT2h无相关性？控制BMI这个影响因素之后对sICAM-1与血糖？血脂代谢指标进行偏相关分析，发现血清sICAM-1与WHR?TG?PCOS患病呈正相关？PCOS患者血清sICAM-1与体质量？BMI?WHR?TG?HOMA-IR呈正相关？提示sICAM-1与PCOS患者血脂代谢以及胰岛素之间关系密切，但是与糖代谢之间的关系不甚明确？PCOS患者向心性肥胖加剧了脂代谢的紊乱，进而可能引发内皮功能紊乱，出现sICAM-1的升高？而PCOS患者的胰岛素抵抗及高胰岛素血症进一步加剧机体代谢紊乱以及内皮功能紊乱的出现？究竟是PCOS血管病变导致血清中sICAM-1升高，抑或是sICAM-1引发PCOS疾病的发生及进展，需要进一步深入进行研究？
　　
　　PCOS 患者糖脂代谢紊乱？肥胖等症状使得其发生心血管疾病的风险大大增加，对于这些患者应该高度重视其远期并发症，早期进行干预和治疗，降低心血管疾病的发生率，提高生存质量？本研究显示血清sICAM-1与PCOS疾病以及HOMA-IR?糖脂代谢关系密切？sICAM-1可作为PCOS患者血管内皮细胞损伤的标志性指标加以监测，连续动态观察sICAM-1含量的变化，可能对PCOS 患者的心血管疾病的防治有重要的指导作用？
　　
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